Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 4830-3:2005

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 4830-3:2005 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 6888-3:2003. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (bao gồm cả vi khuẩn Staphylococcus aureus và các loài khác) trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN). Đây là phương pháp tối ưu được áp dụng khi mật độ vi sinh vật cần kiểm tra ở mức độ nhỏ, giúp đảm bảo độ chính xác cao trong công tác kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chung cho việc phát hiện và định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bằng kỹ thuật MPN. Phạm vi áp dụng cụ thể bao gồm:

• Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn dành cho chăn nuôi động vật.
• Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, chế biến và phân phối thực phẩm.
• Phương pháp này đặc biệt thích hợp cho các trường hợp dự kiến số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase ở mức thấp (thường nhỏ hơn 100 khuẩn lạc trên một gam hoặc một mililít mẫu thử).
• Áp dụng hiệu quả đối với các sản phẩm có chứa các tế bào vi sinh vật bị tổn thương hoặc bị ức chế do quá trình xử lý công nghệ (như gia nhiệt, sấy khô, đông lạnh hoặc nồng độ muối cao).

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, các tài liệu viện dẫn sau đây là cực kỳ cần thiết. Đối với các tài liệu ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Nguyên tắc chung đối với việc kiểm tra vi sinh vật.
• TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) về Phương pháp định lượng staphylococci dương tính với coagulase trên đĩa thạch Baird-Parker.
• TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) về Phương pháp định lượng staphylococci dương tính với coagulase trên đĩa thạch huyết tương thỏ fibrinogen.

Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Trong khuôn khổ tiêu chuẩn này, các thuật ngữ chuyên ngành được định nghĩa cụ thể như sau:

• Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase: Là những vi khuẩn có khả năng hình thành các khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình trên môi trường thạch chọn lọc (như thạch Baird-Parker hoặc thạch huyết tương thỏ fibrinogen) và cho phản ứng đông huyết tương (coagulase) dương tính rõ rệt khi tiến hành thử nghiệm khẳng định.
• Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN): Phương pháp ước lượng mật độ vi sinh vật dựa trên việc cấy các lượng mẫu thử tăng dần (hoặc các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu) vào các ống nghiệm chứa môi trường lỏng chọn lọc, sau đó tính toán kết quả dựa trên số lượng ống nghiệm dương tính bằng cách tra bảng thống kê MPN.

Điều 4: Nguyên tắc thực hiện

Phương pháp phát hiện và định lượng staphylococci bằng kỹ thuật MPN được tiến hành dựa trên các nguyên tắc kỹ thuật cốt lõi sau:

• Sự tăng sinh chọn lọc: Tiến hành cấy một lượng mẫu thử xác định (hoặc các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu) vào ba ống nghiệm chứa môi trường lỏng chọn lọc Giolitti-Cantoni cải tiến có chứa kali tellurit. Tiến hành ủ ấm các ống nghiệm ở nhiệt độ từ 35 độ C đến 37 độ C trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ dưới điều kiện kỵ khí (bằng cách phủ một lớp dầu paraffin hoặc thạch lỏng lên bề mặt môi trường).
• Phân lập trên môi trường đặc: Từ các ống nghiệm có biểu hiện dương tính (môi trường bị đen đi một phần hoặc hoàn toàn do sự khử tellurit), tiến hành cấy chuyển sang bề mặt của môi trường chọn lọc đặc (thạch Baird-Parker hoặc thạch huyết tương thỏ fibrinogen) để phân lập các khuẩn lạc đơn lẻ.
• Ủ ấm và nhận biết khuẩn lạc: Ủ các đĩa thạch đã cấy ở nhiệt độ 35 độ C đến 37 độ C và kiểm tra sau 24 giờ đến 48 giờ để phát hiện sự hiện diện của các khuẩn lạc nghi ngờ staphylococci dương tính với coagulase.
• Khẳng định kết quả: Tiến hành thử nghiệm phản ứng đông huyết tương (coagulase) đối với các khuẩn lạc nghi ngờ thu được từ môi trường thạch Baird-Parker, hoặc trực tiếp xác nhận kết quả nếu sử dụng thạch huyết tương thỏ fibrinogen.
• Tính toán kết quả (MPN): Dựa trên số lượng các ống nghiệm được xác định là dương tính ở mỗi độ pha loãng, tiến hành tra bảng MPN tương ứng để xác định số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam hoặc một mililít mẫu thử ban đầu.