Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13614:2022 về Phân bón - Phương pháp định lượng Bacillus Megaterium - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc quy định quy trình kỹ thuật nhằm xác định mật độ vi khuẩn Bacillus megaterium có trong các sản phẩm phân bón bằng phương pháp nuôi cấy và đếm khuẩn lạc.

- Phạm vi và đối tượng áp dụng

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các loại phân bón vi sinh vật, phân bón hữu cơ vi sinh, phân bón sinh học và các sản phẩm phân bón khác có chứa chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã được đăng ký.
• Đối tượng áp dụng: Các phòng thử nghiệm, tổ chức chứng nhận hợp quy, cơ quan quản lý nhà nước về chất lượng phân bón, cùng các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu và kinh doanh phân bón tại Việt Nam.

- Nguyên tắc của phương pháp định lượng

• Phương pháp dựa trên việc giải phóng các tế bào vi khuẩn Bacillus megaterium từ mẫu phân bón vào dung dịch pha loãng vô trùng.
• Tiến hành pha loãng mẫu theo các nồng độ thập phân liên tiếp để thu được mật độ vi sinh vật thích hợp cho việc đếm khuẩn lạc.
• Cấy một lượng dịch mẫu đã pha loãng lên môi trường thạch dinh dưỡng chuyên biệt hoặc môi trường chọn lọc (như môi trường Pikovskaya để phát hiện khả năng phân giải phốt phát khó tan).
• Ủ các đĩa cấy ở điều kiện nhiệt độ 30 độ C ± 1 độ C trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 72 giờ để các khuẩn lạc phát triển và biểu hiện đặc tính sinh học đặc trưng.
• Xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên một đơn vị khối lượng (gam) hoặc thể tích (mililit) mẫu phân bón ban đầu.

- Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị khử trùng và nuôi cấy: Nồi hấp tiệt trùng (autoclave) hoạt động ở nhiệt độ 121 độ C; tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở mức 30 độ C ± 1 độ C.
• Dụng cụ phòng thí nghiệm: Tủ cấy vô trùng (laminar flow), máy lắc trộn mẫu, pipet tự động các dung tích, đĩa Petri vô trùng, ống nghiệm và các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng khác.
• Môi trường và hóa chất: Dung dịch đệm peptone hoặc nước muối sinh lý vô trùng dùng để pha loãng mẫu; môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar) hoặc môi trường Pikovskaya (chứa nguồn phốt phát khó tan như tricalcium phosphate) để nuôi cấy và nhận diện khuẩn lạc Bacillus megaterium.

- Quy trình tiến hành thử nghiệm

• Chuẩn bị mẫu thử: Cân một lượng mẫu phân bón đại diện (thường là 10 gam hoặc 10 mililit) trong điều kiện vô trùng, chuyển vào bình chứa dung dịch pha loãng để tạo thành dung dịch huyền phù ban đầu có nồng độ 10 mũ -1. Tiến hành lắc đều để giải phóng tối đa tế bào vi khuẩn.
• Pha loãng thập phân: Hút chính xác 1 mililit dịch huyền phù ban đầu chuyển sang ống nghiệm chứa 9 mililit dung dịch pha loãng vô trùng để đạt độ pha loãng 10 mũ -2. Tiếp tục lặp lại thao tác để đạt các độ pha loãng tiếp theo (10 mũ -3, 10 mũ -4, 10 mũ -5...) tùy thuộc vào mật độ vi sinh vật dự kiến trong mẫu.
• Cấy mẫu và ủ ấm: Sử dụng phương pháp cấy trải hoặc cấy đổ đĩa. Hút một lượng dịch mẫu xác định (thường là 0,1 mililit đối với cấy trải hoặc 1 mililit đối với cấy đổ đĩa) từ các độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa thạch. Lật ngược các đĩa cấy và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 độ C ± 1 độ C. Theo dõi và ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc sau 24 giờ, 48 giờ và tối đa là 72 giờ.
• Đọc kết quả và khẳng định: Chọn các đĩa thạch có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng tối ưu từ 30 đến 300 khuẩn lạc để đếm. Khuẩn lạc Bacillus megaterium điển hình trên môi trường thạch thường có kích thước lớn, dạng tròn, màu trắng đục hoặc hơi vàng, bề mặt hơi ướt hoặc nhăn nhẹ. Nếu sử dụng môi trường Pikovskaya, xung quanh khuẩn lạc Bacillus megaterium sẽ xuất hiện vòng phân giải phốt phát trong suốt rõ rệt. Tiến hành các thử nghiệm khẳng định sinh hóa (như nhuộm Gram xác định trực khuẩn Gram dương, thử nghiệm khả năng sinh bào tử, phản ứng catalase) khi cần thiết.

- Cách tính toán và biểu thị kết quả

• Mật độ vi sinh vật (N) trong mẫu phân bón được tính toán dựa trên tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn ở hai độ pha loãng liên tiếp, chia cho thể tích dịch cấy và hệ số pha loãng tương ứng.
• Kết quả thử nghiệm được biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc trên một gam mẫu (CFU/g) đối với phân bón dạng rắn, hoặc trên một mililit mẫu (CFU/mL) đối với phân bón dạng lỏng, viết dưới dạng số mũ cơ số 10 (ví dụ: 1,5 x 10 mũ 8 CFU/g).

- Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13614:2022 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày ban hành công bố. Tiêu chuẩn này đóng vai trò là công cụ kỹ thuật chuẩn hóa, giúp các cơ quan chức năng kiểm soát chất lượng phân bón vi sinh, ngăn ngừa các sản phẩm kém chất lượng lưu thông trên thị trường, đồng thời hỗ trợ doanh nghiệp nâng cao uy tín sản phẩm.