Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13613:2022 về Phân bón - Phương pháp định lượng Trichoderma SPP. - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc quy định phương pháp xác định mật độ nấm Trichoderma spp. trong các loại phân bón bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy thích hợp. Tiêu chuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng phân bón vi sinh vật lưu thông trên thị trường Việt Nam.

Phạm vi và đối tượng áp dụng

• Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các loại phân bón vi sinh vật, phân bón hữu cơ vi sinh và các loại phân bón khác có chứa chủng nấm Trichoderma spp. nhằm mục đích định lượng mật độ vi sinh vật này.
• Đối tượng áp dụng: Áp dụng cho các phòng thử nghiệm, cơ quan quản lý nhà nước, doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu và kinh doanh phân bón tại Việt Nam thực hiện việc kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm.

Nội dung cốt lõi của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13613:2022

- Nguyên tắc của phương pháp định lượng

• Phương pháp dựa trên kỹ thuật đếm khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch chọn lọc sau thời gian nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ thích hợp.
• Mẫu phân bón được hòa tan và pha loãng theo dãy thập phân để thu được nồng độ thích hợp, đảm bảo số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch nằm trong giới hạn có thể đếm chính xác (thường từ 15 đến 150 khuẩn lạc trên một đĩa).
• Mật độ Trichoderma spp. được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được và hệ số pha loãng tương ứng, biểu thị bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên một gam hoặc một mililít mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml).

- Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy

• Thiết bị và dụng cụ: Yêu cầu sử dụng các thiết bị cơ bản trong phòng thử nghiệm vi sinh bao gồm tủ ấm (duy trì nhiệt độ từ 25 độ C đến 30 độ C), tủ cấy vô trùng (laminar), máy lắc mẫu, cân phân tích có độ chính xác cao, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), đĩa Petri vô trùng, pipet và các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng khác.
• Môi trường nuôi cấy và hóa chất: Sử dụng môi trường thạch chọn lọc phù hợp cho sự phát triển của Trichoderma spp. và có bổ sung các chất kháng sinh hoặc chất ức chế để hạn chế sự phát triển của các loài nấm men, nấm mốc khác và vi khuẩn (ví dụ: môi trường Martin cải tiến hoặc môi trường PDA bổ sung kháng sinh).

- Quy trình tiến hành thử nghiệm

• Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành đồng nhất mẫu phân bón. Cân một lượng mẫu xác định (thường là 10g hoặc 10ml) trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để tránh ngoại nhiễm.
• Pha loãng mẫu: Chuyển mẫu vào dung dịch pha loãng vô trùng (nước cất vô trùng hoặc dung dịch peptone muối) để tạo dung dịch ban đầu. Tiếp tục thực hiện pha loãng theo dãy thập phân (10^-1, 10^-2, 10^-3,...) tùy thuộc vào mật độ dự kiến của vi sinh vật trong mẫu.
• Cấy mẫu và nuôi cấy: Sử dụng phương pháp cấy gạt dịch mẫu đã pha loãng lên bề mặt đĩa môi trường thạch đã chuẩn bị sẵn. Tiến hành ủ các đĩa cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ ổn định từ 25 độ C đến 28 độ C.
• Theo dõi và đếm khuẩn lạc: Quan sát đĩa cấy hàng ngày từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7. Nhận diện khuẩn lạc Trichoderma spp. dựa trên các đặc điểm hình thái đặc trưng như hệ sợi nấm ban đầu có màu trắng, sau đó chuyển sang màu xanh lục, xanh lá mạ hoặc vàng xanh khi sinh bào tử. Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa có mật độ phù hợp.

- Tính toán và biểu thị kết quả

• Mật độ nấm Trichoderma spp. trong một đơn vị khối lượng hoặc thể tích mẫu được tính theo công thức tiêu chuẩn dựa trên tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn, thể tích dịch cấy và hệ số pha loãng tương ứng.
• Kết quả cuối cùng được làm tròn và biểu thị dưới dạng số mũ cơ số 10 (ví dụ: Ax10^b CFU/g hoặc CFU/ml).

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13613:2022 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được Bộ Khoa học và Công nghệ công bố ban hành, thay thế hoặc bổ sung cho các phương pháp thử nghiệm trước đó đối với chỉ tiêu Trichoderma spp. trong phân bón.