Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11938:2017 quy định phương pháp sắc ký khí để xác định hàm lượng các phytosterol bao gồm campesterol, stigmasterol và beta-sitosterol trong thực phẩm bổ sung và nguyên liệu thực vật. Dưới đây là tóm tắt chi tiết và chuyên sâu các nội dung cốt lõi từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

- Điều 1: Phạm vi áp dụng

• Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng ba hợp chất phytosterol chính là campesterol, stigmasterol và beta-sitosterol.
• Đối tượng áp dụng bao gồm các sản phẩm thực phẩm bổ sung và các loại nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật.
• Phương pháp này cung cấp quy trình chuẩn hóa giúp các phòng thử nghiệm đánh giá chính xác hàm lượng sterol thực vật, phục vụ công tác kiểm soát chất lượng và công bố hợp quy sản phẩm.

- Điều 2: Tài liệu viện dẫn

• Các tài liệu viện dẫn trong tiêu chuẩn là bộ phận cấu thành không thể tách rời khi áp dụng quy trình phân tích.
• Đối với các tài liệu viện dẫn có ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
• Tiêu chuẩn chủ yếu viện dẫn các quy định về chất lượng nước dùng trong phòng thử nghiệm phân tích (như TCVN 4851 hoặc các tiêu chuẩn tương đương) nhằm đảm bảo không gây tạp nhiễm trong quá trình xử lý mẫu.

- Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp

• Quá trình xà phòng hóa: Mẫu thử được xử lý bằng dung dịch kali hydroxit (KOH) trong môi trường cồn (ethanol) ở nhiệt độ cao để giải phóng các phytosterol từ dạng liên kết (như dạng este hóa) thành dạng tự do, đồng thời loại bỏ các chất béo dễ bị xà phòng hóa.
• Chiết tách chất không xà phòng hóa: Các phytosterol tự do cùng với chất chuẩn nội được chiết tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng bằng dung môi hữu cơ không phân cực thích hợp (thường là hexane hoặc ete dầu mỏ).
• Tạo dẫn xuất (Sily hóa): Phần chiết chứa phytosterol sau khi bay hơi dung môi đến khô sẽ được chuyển hóa thành dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) bằng tác nhân sily hóa. Quá trình này giúp tăng độ bay hơi và độ bền nhiệt của các sterol, tối ưu hóa hiệu quả phân tách trên cột sắc ký khí.
• Phân tích sắc ký khí (GC): Các dẫn xuất TMS-ether của campesterol, stigmasterol và beta-sitosterol được bơm vào hệ thống sắc ký khí, phân tách qua cột mao quản và phát hiện bằng detector ion hóa ngọn lửa (FID) hoặc detector khối phổ (MS). Hàm lượng của từng phytosterol được định lượng dựa trên tỷ lệ diện tích pic giữa chất phân tích và chất chuẩn nội.

- Điều 4: Hóa chất và thuốc thử

• Yêu cầu chung: Tất cả các hóa chất, dung môi được sử dụng phải đạt độ tinh khiết phân tích hoặc dùng cho sắc ký khí. Nước sử dụng phải là nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
• Chất chuẩn tinh khiết: Bao gồm các chất chuẩn campesterol, stigmasterol và beta-sitosterol với độ tinh khiết đã biết (thường lớn hơn 95%).
• Chất chuẩn nội (Internal Standard): Sử dụng chất chuẩn nội phù hợp (ví dụ: 5-alpha-cholestane hoặc dihydrocholesterol) có đặc tính hóa-lý tương tự các phytosterol cần phân tích nhưng không có sẵn trong mẫu thử.
• Dung môi và tác nhân phản ứng chính:
  • Ethanol tuyệt đối hoặc ethanol 95%.
  • Dung dịch kali hydroxit (KOH) nồng độ cao trong nước hoặc trong cồn.
  • Hexane hoặc ete dầu mỏ cấp độ sắc ký dùng cho quá trình chiết.
  • Tác nhân sily hóa: Thường sử dụng hỗn hợp BSTFA (bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) kết hợp với 1% TMCS (trimethylchlorosilane) hoặc MSTFA (N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide).
  • Khí mang cho hệ thống GC: Khí heli hoặc khí nitơ có độ tinh khiết cao (tối thiểu 99,999%).