Tóm tắt Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11136:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm - Phát hiện Bacillus anthracis trong môi trường nuôi cấy bằng phân tích sắc ký khí các metyl este của axit béo

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11136:2015 là văn bản kỹ thuật quan trọng quy định phương pháp phát hiện vi khuẩn Bacillus anthracis (tác nhân gây bệnh than) từ các môi trường nuôi cấy thu được từ mẫu thực phẩm hoặc môi trường liên quan. Dưới đây là nội dung tóm tắt chi tiết từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Điều khoản này xác định rõ giới hạn và đối tượng áp dụng của phương pháp phân tích:

• Phương pháp này áp dụng để phát hiện và định danh sơ bộ vi khuẩn Bacillus anthracis được phân lập từ các mẫu thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hoặc các mẫu môi trường trong chuỗi thực phẩm.
• Kỹ thuật được sử dụng là phân tích sắc ký khí các metyl este của axit béo (FAME - Fatty Acid Methyl Esters) từ sinh khối tế bào vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường thạch thích hợp.
• Tiêu chuẩn này hướng tới việc cung cấp một công cụ sàng lọc nhanh, có độ tin cậy cao nhằm hỗ trợ công tác kiểm soát an toàn thực phẩm và phòng chống các nguy cơ sinh học liên quan đến tác nhân nguy hiểm này.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, cần phải tham chiếu và phối hợp sử dụng với các tài liệu tiêu chuẩn cốt lõi sau:

• TCVN 6404 (ISO 7218) về Nguyên tắc chung đối với kiểm tra vi sinh vật.
• Các tiêu chuẩn liên quan đến việc chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.
• Các tài liệu hướng dẫn về an toàn sinh học phòng thí nghiệm, đặc biệt là các quy định nghiêm ngặt đối với việc xử lý tác nhân truyền nhiễm nhóm nguy cơ cao.

Điều 3: Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn đưa ra các định nghĩa chuyên ngành nhằm thống nhất cách hiểu trong quá trình thực hiện quy trình thử nghiệm:

• Bacillus anthracis: Là loài vi khuẩn hình que, gram dương, sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, có khả năng gây bệnh than ở người và động vật.
• Metyl este của axit béo (FAME): Các hợp chất được tạo ra từ quá trình xà phòng hóa và este hóa các axit béo có trong màng tế bào của vi khuẩn.
• Hồ sơ axit béo (Fatty acid profile): Bản đồ phân bố và tỷ lệ phần trăm của các loại axit béo đặc trưng cho từng loài vi sinh vật, được sử dụng làm cơ sở dữ liệu để định danh bằng phần mềm chuyên dụng kết nối với hệ thống sắc ký khí.

Điều 4: Nguyên tắc của phương pháp

Nguyên tắc của phương pháp phát hiện dựa trên sự khác biệt về thành phần axit béo trong màng tế bào của Bacillus anthracis so với các loài Bacillus khác. Quy trình bao gồm các bước cơ bản sau:

• Nuôi cấy và thu hoạch sinh khối: Vi khuẩn nghi ngờ được nuôi cấy trên môi trường thạch tiêu chuẩn ở điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định để đạt được trạng thái sinh trưởng tối ưu. Thu hoạch một lượng sinh khối tế bào nhất định từ đĩa thạch.
• Xà phòng hóa (Saponification): Giải phóng các axit béo từ lipid màng tế bào bằng cách đun nóng sinh khối tế bào với dung dịch natri hydroxit trong metanol.
• Metyl hóa (Methylation): Chuyển đổi các axit béo tự do thành các metyl este tương ứng (FAME) bằng cách đun nóng với hỗn hợp axit clohydric và metanol. Bước này giúp tăng tính bay hơi của các hợp chất để phù hợp với phân tích sắc ký khí.
• Chiết xuất (Extraction): Chiết các FAME từ pha lỏng phân cực sang pha hữu cơ không phân cực bằng hỗn hợp dung môi ete và hexan.
• Rửa sạch pha hữu cơ (Base wash): Loại bỏ các axit tự do dư thừa và các tạp chất bằng dung dịch natri hydroxit loãng để bảo vệ cột sắc ký khí.
• Phân tích sắc ký khí (GC): Tiêm mẫu FAME đã chiết xuất vào hệ thống sắc ký khí được trang bị cột mao quản và đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID). Hệ thống máy tính sẽ so sánh hồ sơ axit béo thu được với thư viện dữ liệu chuẩn để đưa ra kết quả định danh Bacillus anthracis.