TIÊU CHUẨN NGÀNH

28TCN177:2002

HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Tetracyclines group in fishery products - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 µg/kg.

2 Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracycline, and Tetracycline trong phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 - 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997.

3 Nguyên tắc

3.1 Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinh chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin (gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC).

3.2 Các kháng sinh này trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV.

4.1.2 Cột sắc ký pha đảo gồm có:

a. Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.

b. Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm.

4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút.

4.1.4 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.5 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml).

4.1.6 pH kế

4.1.7 ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml.

4.1.8 Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml và 1 000 ml.

4.1.9 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml.

4.1.10 Phễu Buch-ner đường kính 5,5 cm.

4.1.11 Pipet tự động điều chỉnh được từ 2 đến10 ml.

4.1.12 Bể siêu âm.

4.2 Hoá chất

4.2.1 Ðinatri photphat khan (Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.2 Nước cất loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Axit xitric ngậm 1 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.4 Ethylenđinitrilotetraaxêtat đinatri (sau đây viết tắt là EDTA) ngậm 2 phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.5 Axít oxalic ngậm 2 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích.

4.2.6 Metanol loại dùng cho HPLC.

4.2.7 Axetonitril loại dùng cho HPLC.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0 +/- 0,05) gồm:

a. Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na₂HPO₄ khan (4.2.1) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức dung tích 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.

b. Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít xitric (4.2.3) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.

Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 (+/- 0,05) bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH).

Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.

4.3.2 Dung dịch đệm McIlvaine - EDTA

Hoà tan 60,5 g EDTA (4.2.4) vào 1 625 ml dung dịch đệm McIlvaine (4.3.1).

Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.

4.3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic (4.2.5) bằng metanol (4.2.6) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.

Chú thích: Dung dịch chiết không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.

4.3.4 Pha động cho HPLC: hoà tan 1,26 g axít oxalíc (4.2.5) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (4.2.7) và 166 ml metanol (4.2.6). Lọc và đuổi khí.

Chú thích: Dung dịch pha động không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.

4.3.5 Dung dịch chuẩn gốc 1 000 µg/ml: cân 108 mg (+/- 0,1) mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml (4.1.8) riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol (4.2.6).

Chú thích: Bảo quản dung dịch tại nhiệt độ -20 ⁰C. Dung dịch bền trong vòng 3 tháng.

4.3.6 D