THƯỜNG QUY KỸ THUẬT

XÁC ĐỊNH PHẨM MÀU DÙNG TRONG THỰC PHẨM
(Ban hành kèm theo Quyết định số: 883/2001/QĐ-BYT ngày 22 tháng 3 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

1. NGUYÊN TẮC

Trong môi trường acid, phẩm mầu hữu cơ tổng hợp có tính acid được hấp phụ vào sợi len lông cừu nguyên chất màu trắng, rồi được chiết từ sợi len bằng dung dịch amoniăc, sau đó được định tính bằng phương pháp sắc ký trên giấy và định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.

2. PHẠM VI ÁP DỤNG

Đối với tất cả các loại thực phẩm

3. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT, THUỐC THỬ

3.1. Dụng cụ, thiết bị

- Nồi cách thủy

- Bát sứ 200 ml

- Cốc có mỏ 250 ml

- Cối chày thuỷ tinh

- Máy sấy tóc

- Bình triển khai sắc ký có ử =18 cm, cao 25 cm

- Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

- Thước kẻ

- Bút chì

- Kim, chỉ trắng

- ống đong 50 ml ,100 ml

- Pipet bầu 5ml, 10 ml, 20ml

- Cân phân tích

- Bình lắng gạn 250ml

- Giá để bình gạn

- ống nghiệm ử =18 mm

- Micropipet 50 microlit

- Phễu thuỷ tinh ử =7cm

- Đũa thuỷ tinh

- ống mao dẫn

- Bình định mức 50ml, 100ml, 200ml

3.2. Hoá chất, thuốc thử (loại tinh khiết phân tích)

- Celite

- Nước cất 2 lần

- Giấy chỉ thị màu vạn năng

- Aceton

- Ether thường

- n-hexan

- Acid acetic 10% (đong 10 ml acid acetic đậm đặc thêm nước cất vừa đủ 100ml)

- Dung dịch amoniăc ( NH3) 25 %

- Dung dịch amoniăc ( NH3) 1,25% (Đong 50 ml dung dịch amoniăc 25 %, thêm nước cất 2 lần vừa đủ 1000 ml )

- Giấy lọc thường

- Len lông cừu nguyên chất màu trắng

- Giấy Whatman 1, FN4

- Hỗn hợp nước:Cồn 90o (1:1) (Đong 50 ml cồn 90o thêm nước cất vừa đủ 100 ml)

- Amoni acetat 0,02 M(cân 1,5416g amoni acetat thêm nước cất vừa đủ 1000ml)

- Natri citrat

- Propanol

- Ethyl acetat

- Butanol

- Acid acetic đậm đặc

- Piridin

- Cồn 960

- Quinolin

Phẩm màu trong danh mục cho phép có nồng độ 1g/lit trong amoni acetat 0,02M (Cân chính xác 100mg phẩm chuẩn thêm amoni acetat 0,02M vừa đủ 100ml)

- Tartrazine (102)

- Sunset Yellow (110)

- Carmoisin (122)

- Amaranth (123)

- Ponceau 4R (124)

- Erythrosine (127)

- Indigocarmine (132)

- Brilliant blue FCF (133)

Hệ dung môi khai triển

* Natri citrat (2g) nước (80 ml) amoniăc 25% (20 ml)

* Propanol : ethyl acetate : nước ( 6:1:3 )

* Butanol : nước : Acid acetic ( 20:12:10 )

* Butanol : nước : pyridin : cồn 960 (4:5:2:2 )

* Butanol : nước : cồn 960 : quinolin (4:5:3:2)

4. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

4.1. Chuẩn bị mẫu

4.1.1 Đối với các sản phẩm dưới dạng lỏng như rượu, nước giải khát....

Lấy chính xác 50ml dung dịch mẫu thử cho vào bát sứ dung tích 200ml.Đặt trên nồi cách thuỷ sôi 100oC để đuổi cồn hoặc khí CO₂ có trong dịch thử, sau đó acid hoá bằng CH₃COOH 10% đến pH=5(kiểm tra bằng giấy chỉ thị màu vạn năng).

Cho một sợi len lông cừu nguyên chất màu trắng dài khoảng 50cm vào mẫu thử, tiếp tục đun trên nồi cách thuỷ sôi tới khi sợi len đã hấp phụ hết phẩm màu từ dịch thử (dung dịch trong bát không còn màu nữa, nếu dung dịch còn màu thì cho thêm len vào để nhuộm tiếp). Vớt sợi len ra rồi rửa sạch dưới vòi nước và tráng lại bằng nước cất, vắt khô sợi len.

Cho sợi len đã hấp phụ màu vào bát sứ, thêm 10ml dung dịch amoniăc 1,25% để chiết màu từ sợi len ra. Khi màu đã thôi ra dung dịch amoniac, chắt dung dịch màu này ra một bát khác. Làm như vậy 3 lần đến khi sợi len hết màu. Lúc này phẩm màu đã được thôi hết ra dung dịch amoniăc.

Tập trung tất cả dịch chiết vào một bát sứ, làm bay hơi trên nồi cách thuỷ đến vừa cạn, cặn này dùng để định tính bằng sắc ký trên giấy. Sau đó định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS .

Ghi chú: Khi cho dung dịch amoniăc 1,25% vào, nếu sợi len chuyển thành màu xanh lục xỉn thì sản phẩm đã dùng màu tự nhiên để chế biến.

4.1.2. Đối với các sản phẩm nhuộm màu dưới dạng đường bột như kẹo...

Cân chính xác khoảng 20g kẹo cùng màu cho vào cốc có mỏ dung tích 250ml, thêm 50ml nước cất, ngâm cho thôi hết màu ở kẹo ra. Gạn lấy dung dịch màu đem acid hoá bằng dung dịch CH₃COOH 10% đến pH=5. Tiếp tục tiến hành bước nhuộm len và chiết màu từ len ra bằng dung dịch amoniăc 1,25% như trường hợp 4.11

4.1.3. Đối với các sản phẩm nhuộm màu dưới dạng chất béo như mỡ, bơ, kem bánh ga tô...

Cân chính xác khoảng 20g mẫu cùng màu cho vào cốc có mỏ dung tích 250ml, thêm 50ml nước cất, đặt trên nồi cách thuỷ sôi cho tan hết bơ, mỡ...Tiếp tục đun thêm 15 phút nữa cho mầu trong mẫu tan hoàn toàn trong nước rồi làm lạnh trong tủ lạnh và vớt bỏ lớp chất béo đã đông lại. Phần dung dịch có màu đem acid hoá bằng dung dịch CH3COOH 10% đến pH=5.Tiếp tục tiến hành bước nhuộm len và chiết màu từ len ra bằng dung dịch amoniăc 1,25% như trường hợp 4.11.

4.1.4 Đối với các sản phẩm như bánh qui, thịt, lạp xường, sữa chua...

Cân chính xác khoảng 20g mẫu thử cho vào cối sứ dung tích 250ml, thêm 10g celite. Nghiền kỹ, thêm 10ml nước cất, tiếp tục nghiền thành bột nhão. Cho thêm 30 ml aceton, nghiền tiếp cho màu trong chất thử thôi ra. Lọc dịch chiết vào bình gạn. Chiết bã còn lại 2 lần nữa với aceton, mỗi lần 30ml. Tập trung tất cả dịch chiết vào bình lắng gạn . Thêm vào bình gạn 30ml nước cất, lắc đều rồi lại thêm 30ml n- hexan để loại bỏ chất béo có trong dịch chiết. Lắc kỹ nhẹ rồi để lắng cho tách thành 2 lớp.

- Lớp trên là n- hexan có chứa chất béo

- Lớp dưới gồm phẩm màu tan trong nước và aceton.

Rút lấy phần dưới ra một bát sứ dung tích 200ml . Để bay hơi dịch chiết trên nồi cách thuỷ sôi cho tới khi hết hơi dung môi rồi acid hoá bằng dung dịch CH3COOH 10% đến pH=5. Tiếp tục hấp phụ màu vào len và chiết màu từ len ra bằng dung dịch amoniăc 1,25% như trường hợp 4.11

4.2 Phát hiện phẩm mầu hữu cơ tổng hợp có tính kiềm không được phép dùng trong chế biến thực phẩm.

Vì không được phép dùng trong thực phẩm bất kỳ một phẩm màu kiềm nào, cho nên trước hết nên kiểm tra sự có mặt của nhóm này.

Tiến hành: Cho 5ml dung dịch thử vào ống nghiệm, thêm 5 giọt amoniăc 25% và 5ml ether thường. Lắc kỹ, rót lớp ether sang ống nghiệm khác, bỏ phần nước. Dù lớp ether có mầu hay không tiến hành như sau:

- Rửa lớp ether bằng cách lắc với nước. Lấy lớp ether, bỏ phần nước, lặp lại nhiều lần.

- Cho thêm 5ml dung dịch acid acetic 10% và lắc.

Đánh giá: dung dịch Acid acetic bên dưới có mầu là phẩm kiềm không được phép sử dụng.

4.3. Định tính phẩm mầu hữu cơ tổng hợp tan trong nước bằng kỹ thuật sắc ký trên giấy.

4.3.1. Phương pháp tiến hành

- Chuẩn bị giấy sắc ký

Chuẩn bị giấy sắc ký Whatman 1 hoặc FN4 có kích thước 20 x 30cm. Dùng bút chì đen kẻ một đường thẳng song song và cách cạnh đáy 2,5cm đồng thời chia thành những đoạn cách nhau 2cm và cách mép giấy 3 cm. Đánh dấu tên mẫu bằng bút chì đen.

- Chuẩn bị bình sắc ký

Bình có chiều cao 25 cm, đường kính 18 cm, đáy bằng. Đổ 1 trong 5 hệ dung môi khai triển vào bình, lớp dung môi có chiều dầy là 1,5 cm, đậy nắp bình.

Để bão hoà trong 30 phút.

- Tiến hành chấm sắc ký

+ Hoà cặn mẫu thử đã chiết bằng 0,5 ml dung dịch cồn : nước (1:1)

+ Trước khi chấm dùng máy sấy, sấy nhẹ giấy sắc ký. Dùng micropipet chấm 10 - 20 microlit mẫu phẩm màu chuẩn trong danh mục cho phép, rồi đến mẫu phân tích. Vết chấm phải gọn, có đường kính khoảng 3mm. Sau mỗi lần chấm, sấy nhẹ để cho vết chấm khỏi loang rộng. Sau đó dùng kim, chỉ trắng khâu tờ giấy lại thành hình trụ, mép giấy cách nhau khoảng 0,5 cm.

- Triển khai sắc ký

Đặt cuộn giấy sắc ký đã chấm ở trên vào bình sắc ký theo chiều thẳng đứng (tránh chạm vào thành bình) đậy nắp bình, để yên cho dung môi thấm trên giấy. Khi tuyến dung môi chạy đến cách mép trên giấy sắc ký khoảng 2,5cm (khoảng 1 - 2 giờ tuỳ theo hệ dung môi). Lấy ra để bay hết hơi dung môi trong tủ hốt tới khô.

4.3.2. Đánh giá kết quả

So sánh màu sắc và vị trí của vết các phẩm màu thử với vết của các phẩm chuẩn trong danh mục cho phép. Nếu một phẩm mẫu thử có màu sắc và vị trí của vết ngang với vết của một phẩm chuẩn nào trên sắc ký đồ( tức Rf của mẫu thử = Rf củamẫu chuẩn) thì có thể kết luận la phẩm được phép sử dụng.

4.4. Định lượng phẩm màu hữu cơ tổng hợp tan trong nước bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.

Bước 1: Làm giầu mẫu bằng cách hoà cặn đã chiết được bằng 0,5ml dung dịch cồn: nước (1:1). Dùng micropipet chấm toàn bộ thể tích thành nhiều chấm trên tờ giấy sắc ký đã chuẩn bị, rồi tiến hành triển khai sắc ký. Sau khi chạy sắc ký các vết phẩm mầu đã tách ra, dùng kéo cắt các vết màu trên giấy để riêng từng loại, rồi chiết màu nhiều lần bằng dung dịch amoni acetat 0,02 M cho đến vừa đủ 10ml, dung dịch này đem định lượng trên máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS ở những vùng có bước sóng thích hợp cho từng loại phẩm màu.

Chuẩn bị mẫu trắng là dung dịch amoni acetat 0,02M.

Bước 2: Xây dựng đường chuẩn với những nồng độ biết trước từ dung dịch chuẩn mẹ. Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ phẩm chuẩn cho trước. Dựa vào đồ thị đó sẽ tính được nồng độ của chất cần xác định.

Pha thang chuẩn cho mỗi loại phẩm màu có các nồng độ như sau: 0,001. 0,003. 0,006. 0,009. 0,012mg/ml. Đem đo trên máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS với cuvet có chiều dầy 1cm và vẽ đường chuẩn.

Phổ hấp thụ thích hợp cho mỗi loại phẩm mầu:

Tính kết quả: Nồng độ phẩm mầu trong 100 gam thực phẩm

Công thức:

Trong đó:

- C : Nồng độ chất màu trong 100g thực phẩm (mg)

- Cx : Nồng độ chất màu tìm được từ đồ thị chuẩn

- V: : Thể tích pha loãng (ml)

- a: Lượng mẫu cân dùng phân tích gam hoặc ml

Ghi chú:

- Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,001mg/ml

- Độ thu hồi của phương pháp là 90%

- Sai số của phương pháp 10%